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核酸提取纯化简介

更新时间  2022-03 阅读 255

核酸是生命最基本的物质之一,可分为DNA和RNA,广泛存在于动物、植物细胞、微生物等所有生命体中。它不仅起着储存和传递遗传信息的作用,而且在蛋白质的生物合成中起着重要的作用,从而在生长、遗传和变异等一系列重要的生命现象中起着决定性的作用。核酸提取包括DNA提取、RNA提取和质粒提取。核酸是遗传信息的载体,是基因表达的物质基础,也是分子生物学研究的主要对象。无论如何研究核酸的结构或功能,首先都需要提取核酸和纯化。

博科核酸提取仪

博科核酸提取仪是通过使用匹配的核酸提取试剂,可以自动提取样品核酸的仪器。博科核酸提取仪可分为两类:一类是大型自动液体工作站;另一种是小型自动核酸提取器,利用包装好的配套试剂自动完成提取纯化流程。大型自动液体工作站由于设备成本高,运行成本高,适合一次提取数千个同类样品,很少使用。而小型自动化仪表因其设备和运行费用低、操作方便而被广泛使用。



核酸提取纯化方法

自1869年发现核酸以来,许多研究者对核酸的提取方法进行了不懈的探索,改进了核酸的各种原料和试剂,十二烷基磺酸钠、苯酚、尿素、胍盐等各种试剂都被应用于核酸的提取实验,这些试剂都用于/kloc。其中,传统的提取方法主要有苯酚提取法、碱裂解法、CTAB提取法和EtBr-CsCl梯度离心法。这些传统的提取方法可以从不同的组织样本中分离出DNA和RNA,但这些技术包括沉淀、离心等操作步骤,需要大量的生物样本,提取步骤复杂、费时费力,产率不高,难以实现自动化操作。此外,大多数传统方法还需要有毒的化学试剂,这对操作者的健康有潜在的危害。因此,随着分子生物学和高分子材料的发展,它们从液相体系中分离出来。


固体载体吸附法:


基于固体吸附质载体的新型核酸萃取方法主要有:旋转离心柱萃取法、玻璃珠吸附法、硅胶基质法、阴离子交换法、纳米磁珠萃取法。该方法的操作步骤可分为三部分:


(1)使用溶胞产物促进细胞破裂并释放核酸进入液相


(2)利用载体对核酸的强亲和力和吸附作用,释放出的核酸特异性结合于特定载体,使其他杂质如蛋白质、多糖、脂质等仍游离于液相中,并随着上清液的去除而被去除。


(3)通过调节洗脱液的离子强度和pH值,将吸附在载体上的核酸洗脱下来,得到纯化 post-核酸。


其中,离心柱DNA提取试剂盒因其价格低廉,操作相对方便,在市场上被广泛使用。然而,随着DNA提取需求的不断增加,离心柱DNA提取的缺点也日益突出。样品需求量大,损耗大,对稀有样品无能为力,成为离心柱法不可避免的缺点。同时,离心柱法提取DNA的过程需要反复离心,不便于高通量和自动化操作,不符合现代生物实验的要求。为了满足现代分子生物学高通量、高灵敏度和自动化操作的发展需要,磁珠提取DNA技术于20世纪90年代诞生。其原理是磁珠表面具有特定的活性基团,在特定条件下可以与核酸发生特异性可逆结合。同时,利用磁珠本身的磁响应能力,在外加磁场的作用下,磁珠可以很容易地发生移动和定向富集,从而实现核酸的分离。



磁珠法核酸提取的优点


磁珠DNA提取是纳米技术和生物技术的完*结合,具有其他DNA提取方法无法比拟的优势:


1.样品需求低:微量物质可称为高浓度核酸;


2.操作简单快捷:整个操作过程基本分为五个步骤(裂解、合并、洗涤、干燥、洗脱),全程无需离心操作,大部分可在30~60分钟内完成;


3.质量稳定可靠:游离磁珠与核酸的结合量较大,特异性结合使得核酸纯度较高,并且核酸的回收量可以通过控制磁珠表面基团来调节;


4.全自动操作:核酸 extractor可实现自动化、高通量操作,一键可提取几十个甚至上百个样品;


5.安全无毒无害:试剂不含苯酚、氯仿等有毒化学试剂,完全符合现代环保理念。


磁珠法核酸提取注意事项


生物磁珠提取核酸在国内还是一种比较新的核酸的提取方法。相对于传统的异戊醇萃取法和离心柱试剂盒法,很多人对这种方法并不了解,在用磁珠纯化核酸的过程中也存在一些误区。


1.误区一:磁珠用的越多,提取效果越好。


很多老师喜欢在提取效果不好的时候加大磁珠的量。他们认为如果加入更多的磁珠,可以吸收更多的核酸。不得不说,这种想法是不可取的。


磁珠的主要特点是在外磁场的作用下,能以固态分散在液体中或与液体分离。在任何试剂体系中,磁珠与液体的比例都应该有一定的阈值。如果超过一定比例,过多的磁珠会因为不能均匀分散在液体中而失去分散特性,在洗涤过程中核酸磁珠与液体的接触效率不能充分提高。过多的磁珠也会吸附更多的杂质,对除杂的效果影响很大。有时,过多的磁珠会吸附液体体系中起主要作用的蛋白酶、溶菌酶等功能成分,导致整个试剂盒效率低下。很多时候提取效果不好的时候,减少磁珠的用量是提高提取效果的*好方法。


通常情况下,磁珠法试剂盒给出的参比磁珠量略过量,因此很少有需要增加磁珠量来提高吸附效率的情况。但是,如果确定由于磁珠量不足导致提取效果差,则可以通过在一定范围内增加磁珠量来提高提取效果。


提取常量样品(植物组织、全血等)时。),通常用量为10ul/次;提取微量样本(如血清游离DNA、口腔拭子等)时。),磁珠量15~20ul/次。如果需要超过这个使用量,需要和技术工程师沟通。


2.误区二:试剂用的越多,提取效果越好。


破解效果差?添加更多的裂解溶液。洗涤效果不好?多加洗洁精。这是很多客户在使用套件时的惯性思维。


但是对于磁珠法来说,每增加一次液体的体积,就会减少更多磁珠的碰撞概率,减少磁珠的碰撞概率会导致吸附率的大幅下降。所以在很多情况下,虽然增加裂解液和洗涤液确实能起到增强裂解和洗涤的作用,但磁珠提取的核心是磁珠吸附效率核酸,磁珠的碰撞效率无法保证,所以单纯增加试剂用量来提高提取效果不一定完全有效。


对于博科核酸提取试剂盒,通常裂解液的量不应超过400微升/次,洗涤液的量不应超过500微升/次。如果真的需要扩增系统,磁珠和样品的量也要相应增加,扩增不一定等于比例。


3.误区三:洗涤次数越多,萃取效果越好。


当提取的核酸杂质过多时,用户会考虑多洗几次,以得到更纯的核酸。增加洗涤次数确实有利于核酸的纯化,但考虑到每次洗涤都会损失一定量的核酸并增加核酸裂解水解的可能性,一般来说,洗涤次数控制在2~4次为宜。



4.误区四:取样越多,提取效果越好。


当样本不够新鲜或者核酸本身含量很少时,核酸的提取效果往往不好,很多老师会通过多样本的方式来增加核酸的提取量。


但单纯增加样品量有时会引入过多杂质,超过裂解液的裂解能力,降低提取效率,所以不建议单纯增加样品量来增加提取量。


如果由于样本量不足,提取量确实太低,建议先预处理后富集或浓缩后再提取。或者增加破解的完备性,暴露更多核酸也是一个解决方案。


5.误区五:如果某一种磁珠是好的,那么它应该在所有实验中都很好用。


磁珠的种类很多,不同的粒径、分散性、磁响应时间、包覆的基础基质、外部修饰的官能团、包覆的密度、官能团的臂长都会导致磁珠的特性不同。


所以不同的磁珠所适应的实验和系统也是不同的。就像核酸 extraction同样的试剂,配方不完全一样,用于核酸 extraction的磁珠性质也不完全一致。


有些磁珠在constant 核酸萃取中表现出更高的吸附效率,有些磁珠更适合micro 核酸萃取。有些磁珠适用于偏酸性系列试剂体系,有些磁珠适用于偏碱性系列试剂体系。有些磁珠磁响应好但沉降速度快,比较适合磁棒自动提取器。有些磁珠沉降速度慢,但磁响应时间长,更适合移液自动提取器。


少数几种磁珠可以用于所有实验。大多数情况下,磁珠和试剂系统需要调整一定时间,固定试剂盒除外。


6.误区六:与某个套件相比,效果不好,就是磁珠不好。


很多客户在筛选磁珠的过程中,简单的在成熟的试剂体系下等量更换磁珠,比较磁珠的效果。


这样就很容易得出某些磁珠效果不好的结论,但实际上由于不同的磁珠有不同的适用体系和用量,往往需要调整才能获得更好的提取效果。



博科核酸提取仪纯化核心参数

提取原理、机械原理、提取时间、样品处理量、样品管容量、吸头处理量、吸头数量、接口、仪器重量和仪器尺寸。


博科核酸提取仪 纯化应用领域

几乎在每一个实验室中,与生物分子相关的分离纯化工作都是非常重要和必不可少的。但是,在多个样本上执行纯化还是相当困难的。不仅需要选择合适的纯化技术,而且工作量极大,难以满足当前高通量样品提取纯化的快速发展。博科BNP96磁珠提取纯化系统采用磁珠法技术,可同时操作1-32个样本,可广泛应用于基因组学、疾病控制与医疗、食品安全、法医鉴定等领域。


1.基因组学


博科BNP96磁珠提取纯化系统非常适合基因组学研究。无论提取样本的来源是微生物、动物、植物还是病毒,结合博科BNP96磁珠提取纯化系统专门优化的天龙全血基因组DNA提取试剂盒、白细胞层全血基因组DNA提取试剂盒和动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒,都可以快速提取足够数量和纯度的DNA或RNA纯化。高质量核酸可以满足下游应用的需求(如PCR/实时PCR、基因芯片、Southern印迹、Northern印迹)。、


2、疾病控制中心


基于博科BNP96磁珠提取纯化的快速高通量技术,可用于解决甲型H1N1流感病毒亚型、儿童手足口病、麻疹病毒等疾病快速自动化监测系统。,提高重大疫情的应对能力。天龙病毒DNA/RNA提取试剂盒可高效用于棉签、血清等样品的RNA提取,尤其适用于低拷贝复杂样品。将原始病毒含量为7.5TCID50/100μl的肠道病毒EV-71株(FY04-R5-C1)用5个稀释度稀释10倍,分别用离心柱和天龙NP968磁珠纯化 system提取100μl样品。RNA提取后实时PCR检测结果。(来源:中国疾病预防控制中心)


3.临床样本的分子诊断


博科BNP96磁珠提取纯化系统可快速高通量处理临床样本,提取的核酸可用于后续分子诊断。博科BNP96结合天龙FFPE组织基因组DNA提取试剂盒也适用于福尔马林固定和石蜡包埋的组织样品。


4.畜牧兽医


它能高效、灵敏地提取禽流感病毒、新城疫病毒、猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、贝氏柯克斯体等。


5.法医学的应用


对于法医工作来说,核酸提取效率和稳定性非常重要。天龙NP968磁珠提取纯化系统配合特殊法医样本核酸磁珠提取试剂使用,可从不同来源的材料中提取纯化高质量DNA,包括烟蒂、发根、软骨、指甲、血渍等。,*大吞吐量为32个样本/次。



核酸 extraction 纯化常见问题

Q1:在提取的质粒中加入缓冲液3后,增加离心速度和时间对提取的产物有什么影响?


A1:加入缓冲液3后,增加新转速和离心时间确实有利于沉淀更紧密的附着,但在常温下。


如果离心时间过长,液体温度会升高,导致质粒降解。一般可以在4℃,12000rpm离心。


10分钟,或在常温下以12000转/分钟离心3-4分钟。


Q2:回收琼脂糖凝胶时,如果回收的DNA片段太短怎么办?


A2:如果回收的DNA片段小于500bp,为了提高回收效率,可以加入凝胶溶液溶解凝胶。


之后,加入凝胶块体积1.5倍的异丙醇,并完全倒置混合。


Q3:回收琼脂糖凝胶时,溶胶后凝胶溶液颜色异常如何处理?


A3:凝胶溶液完全溶胶后,正常颜色应为淡黄色。若颜色变为红色或橙色,需加入5μl 5M NaAc(pH5.2)调节溶液的pH值,使混合液颜色恢复正常的浅黄色(若不调节pH值,会影响DNA的回收率)。


问题4:如何确定基因组DNA提取中裂解液体积和样品质量的关系:


A4:理论上,裂解液体积越大,样品量越少,提取的产品质量越好。因此,应在实验前探索和优化裂解物体积与样品质量的*佳比例。以下仅为1ml裂解液可裂解样品量的推荐值,仅供参考。


Q5:提取基因组DNA时,可以采用哪些方法来提高产品产量?


A5-1:适当增加裂解物体积与样品质量的比值。


A5-2:预先将洗脱液预热至65℃左右。同时,上柱时要小心地将洗脱液加到吸附膜的中部,并保证液体完全覆盖膜。


A5-3:如果样品裂解后的混合溶液体积太大,需要多次上柱,每次上样量不得超过700μl。


A5-4:适当延长组织的匀浆和裂解时间。


Q6:为什么提取产品的A260/A280比值较高?


A6:纯DNA的A260/A280比值在1.8到2.0之间。如果样品中有大量的RNA,A260/A280比值会更高,在提取过程中要加入RNase A(如果按照提取过程中的说明加入RNase A,要考虑RNase活性降低的可能性)。



问题7:提取血液基因组DNA前样品处理的注意事项?


A7-1:人血中含有大量可能干扰下游DNA分析的酶抑制剂,其他常见的抗凝剂如干扰素、EDTA等也会干扰下游检测。因此,在从人的血液中分离DNA时,需要有一种方法能够提供高质量的DNA,并且不含污染物和酶抑制剂。


A7-2:哺乳动物红细胞不含核酸,但健康哺乳动物红细胞含量比白细胞(包括淋巴细胞、单核细胞、颗粒白细胞等)高近1000倍。)含有核酸,所以在提取基因组DNA前去除红细胞可以提高DNA产量。推荐的方法如下:


A7-2-1:选择性溶解红细胞:在低渗缓冲液条件下,红细胞会处于早期低渗休克状态,迅速破裂。


A7-2-2: Ficoll密度梯度离心可回收单核细胞(淋巴细胞和单核细胞),去除红细胞(此法也可去除粒细胞)。


a7-2-3:3300g全血室温离心10min,然后分三层:上清液层为质粒;中间层是白细胞层;底层含有浓缩的红细胞。


A7-3:鸟类、鱼类和青蛙的红细胞中含有核酸,所以不需要对红细胞进行处理。


A7-4:血液样本(包括去除红细胞的血液样本)可被裂解液和蛋白酶或蛋白酶k有效裂解


A7-5:除了动物基因组DNA之外,也可以从血液中分离出病毒和细菌DNA。


Q8:提取总RNA时,如何确定裂解液与样品量的关系?


答8:理论上,裂解液体积越大,样品量越少,提取的产品质量越好。因此,应在实验前探索和优化裂解物体积与样品质量的*佳比例。以下仅为1ml裂解液可裂解样品量的推荐值,仅供参考。


问9:提取总RNA时如何处理样品?


A9-1:理论上,样品越新鲜,总RNA质量越好。如果不能及时提取,样品需要用液氮快速冷冻,然后一直保存在-80℃。样品反复冻融对提取的RNA质量影响很大。


A9-2:断裂:完全破坏组织结构、细胞壁和质膜对于释放样品中的所有RNA是非常必要的。不同的样品需要不同的方法才能达到彻底粉碎的效果。不完全片段化会导致RNA产量显著下降。


A9-3:匀浆:匀浆是破碎后降低细胞裂解液粘度所必需的。匀浆可以切断高分子量基因组DNA和其他高分子量细胞成分,获得均一的裂解产物。匀浆不完全会导致RNA结合效率下降,产量显著降低。


A9-4:不同样品处理方法的建议


Q10:RNA提取后如何定量?


A10-1:检测RNA样品时,需要确保比色皿中已去除RNA酶,尤其是测定后仍需回收RNA时(操作方法可依次用0.1M NaOH、1mM EDTA、无RNA酶水清洗)。


A10-2:使用紫外透明塑料比色皿的分光光度计,测量A260的吸光度时,读数应在0.15-1.0之间。在A260波长下,一个单位的吸光度对应于44μg/ml的RNA浓度(这种相关性只对中性pH值条件下的检测有效。因此,为了稀释RNA样品,应使用具有中性pH值如pH7.0的低盐缓冲液和10mM Tris HCl。)


A10-3:RNA定量的例子


RNA样品体积=100μl


稀释=10μl RNA样品+490μl 10mM Tris HCl,pH7.0(稀释比1:50)


使用1ml RNase酶比色皿检测稀释样品的吸光度。


A260=0.2


RNA浓度


=44微克/毫升×260×稀释倍数


= 44微克/毫升× 0.2× 50


=440微克/毫升