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仪器博物馆:从诞生到发展,核酸提取仪知识大全

更新时间  2022-06 阅读 38

新型冠状病毒(2019-nCoV)在全球大规模爆发,让“核酸检测”进入公众视野。在新冠肺炎的全球诊断标准中,基于荧光定量PCR的核酸检测是“金标准”。与PCR一起出现的还有另一个关键设备-核酸提取仪,它是利用匹配的核酸提取试剂自动完成样本核酸提取的仪器。在核酸检测过程中,核酸提取作为预处理,对最终分析结果的准确性起着重要作用。Automatic 核酸提取仪是大规模人群核酸快速检测的重要技术支撑。核酸提取仪已广泛应用于环境微生物检测、食品安全检测、法医鉴定、疾病控制与医疗、生物研究、畜牧业等诸多领域。


今天科普一下它的发展历史,检测原理,结构等。,并对核酸提取仪给出了透彻的解释。



核酸提取仪.jpg

01

“核酸提取仪”的诞生和发展

新型冠状病毒的检测需要五个步骤:取样、留样、保存、核酸提取和计算机检测。大多数临床样本的核酸浓度相对较低。从复杂的生物样品中提取高纯度的核酸对保证核酸检测的高灵敏度和高准确度起着关键作用。


核酸提取是指从复杂系统中分离和纯化核酸。核酸分子的完整性、纯度、样品溶解率和核酸吸附率可以作为核酸提取效率的指标。


1869年,瑞士医生和生物学家弗里德里希·米舍夫(Friedrich Miescherf)分离出一种叫做核酸的核酸;。


20世纪80年代初,德国生物化学家艾布莱希特·科塞尔进一步提纯了核酸;


1889年,德国病理学家理查德·奥特曼创造了核酸这个术语。


1938年,英国物理学家和生物学家威廉·阿斯特伯里和弗洛伦斯·贝尔(后改名为弗洛伦斯·索耶)发表了头一张DNA的X射线衍射图;


1953年,美国分子生物学家詹姆斯·沃森和英国分子生物学家弗朗西斯·克里克确定了DNA的结构。


此后,研究人员不断改进提取材料和方法,发展了一系列核酸提取技术。其开发过程如下:





02

“核酸提取仪”的原理

核酸提取仪的工作原理


目前核酸提取仪的工作原理主要分为磁珠法和柱法,其中磁珠法占据当前市场的主流地位。


磁珠的工作原理主要是利用磁珠对核酸的特异性识别和高效结合,通过磁珠吸附核酸达到分离效果。常见的磁珠类型包括氧化锆磁珠和二氧化硅磁珠。根据磁珠与液体的分离方法,提炼出磁选机法和抽吸法,其原理和过程相同。



磁珠提取过程示意图(来源网络)

磁珠法核酸提取仪的特点


1.高效、简单、高通量操作、操作简单、时间短。


2.它灵活稳定,可实现自动化操作,重复性高。


3.安全环保,减少对操作者身体的伤害。


4.价格低廉,能满足数据库建设。


5.核酸质量稳定、纯度高


柱萃取的工作原理主要是利用硅胶对核酸的特异性吸附。在高盐低pH的环境下,将核酸吸附在硅胶膜上,然后通过离心或洗脱(洗脱液为低盐高pH溶液)将其剥离,达到分离的目的。一般通量为1-12个样本。与手工提取相比,操作时间没有明显优势,目前主要用于实验室研究。




03

“核酸提取仪”的分类

根据不同类型的仪器。

1)自动液体工作站

自动液体工作站是一个非常强大的设备,它可以自动分配和吸取液体,甚至通过集成扩增和检测功能,实现标本提取、扩增和检测的全自动化。提取核酸只是其功能的一个应用,不适合常规的实验室提取核酸。一般适用于单一种类标本的实验要求,一次可抽取非常大量的标本(至少96个,一般为数百个)。自动化工作站平台的建立和运行需要相对较大的资金。

2)小型自动核酸提取仪

小型自动化仪器通过操作结构的特殊性,可以自动提取核酸,可以应用于任何实验室。

根据不同的提取原理。

1)仪器采用离心柱法

离心柱法核酸提取仪主要采用离心机和自动移液装置相结合的方法。通量一般为1-12个样品,操作时间与人工提取几乎相同。不能提高实际工作效率,而且贵。不同类型仪器的耗材不能通用,只适合资金充足的大实验室。

2)使用磁珠法的仪器

以磁珠为载体,基于磁珠在高盐低PH值下吸附核酸,在低盐高PH值下与核酸分离的原理,通过移动磁珠或转移液体即可实现核酸提取纯化的全过程。由于其原理的独特性,可以设计成多种通量,单管或8-96个样品即可提取。而且其操作简单快捷,提取96个样品仅需30-45分钟,大大提高了实验效率,成本低廉。因此可以在不同的实验室使用,是目前市场上的主流仪器。

根据工作性质。

1)手工提取核酸存在操作步骤复杂、效率低、核酸纯度低等问题。


2)全自动核酸提取是利用匹配的核酸提取试剂快速提取样品核酸,具有操作简单、准确度高、稳定性强等优点。在此次新冠肺炎疫情中,高通量自动核酸提取仪在大规模人群核酸检测中发挥了重要作用。

04

“核酸提取仪”的应用

核酸提取仪是生物分子相关分离纯化实验室中非常重要的仪器,可广泛应用于基因组学、疾病控制和医疗、临床诊断、法医鉴定等领域。

1.基因组学


无论提取样品的来源是微生物、动物、植物还是病毒,核酸提取仪结合试剂盒可以快速纯化足够数量和纯度的DNA或RNA。高质量的核酸可以满足下游应用的需要(如PCR/实时PCR、基因芯片、Southern印迹和Northern印迹)。


2.疾控中心疾病预防控制


基于全自动核酸提取仪的快速高通量技术,可用于解决甲型H1N1流感、儿童手足口病、麻疹病毒等的快速自动化疫情监测系统。,提高重大疫情的应对能力。


3.临床样本的分子诊断


该核酸提取纯化系统能够快速、高通量地处理临床样本,提取的核酸可用于后续的分子诊断。它也适用于福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的组织样本。


4.畜牧兽医


它能高效、灵敏地提取禽流感病毒、新城疫病毒、猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、贝氏柯克斯体等。


5.法医学的应用


对于法医工作来说,核酸提取的效率和稳定性非常重要。核酸提取仪与法医样本核酸提取专用磁珠试剂配合使用时,可从包括烟头、发根、软骨、指甲、血渍等不同来源的材料中纯化出高质量的DNA。

05

“核酸提取仪”常见问题及解决方法

1.磁棒核酸提取仪手工提取与电脑提取有显著差异。

磁棒式核酸提取仪通常使用磁性保护套(搅拌套)转移磁珠并均匀混合液体,深孔板底部使用加热模块加热深孔板孔内液体,从而模拟人工操作过程。手工提取的实验结果只能说明手工操作过程和试剂光环没有问题,转到仪器后要综合考虑。


磁珠法的一般操作流程:裂解、结合、洗涤、洗脱可在手工操作中分步实现。但为了限度避免人工操作,通常在一个孔内进行破解和组合。客户一般使用酒精作为粘接液,不仅稀释了裂解液,也影响了裂解效率。而且由于孔内液体温度上升,酒精挥发影响键合效率。另外,仪器一般采用底部加热方式,孔内温度无法以仪器设定温度为准,不同厂家的仪器加热效率也会有所不同。所以光这一步就要在电脑上优化系统。


2.磁棒核酸提取仪孔位置提取效率不同。


磁条型核酸提取仪一般用卡片或黄色钢球固定96孔深孔板,底部有槽形加热片。在进行加热条件下的实验时,如果深孔板的孔与底部的加热槽没有紧密贴合,会直接影响实验结果。这种安静的情况导致了孔间实验结果的不稳定。如果发现一个固定孔的提取结果总是与其他孔有较大差异,可以考虑仪器的加热模块是否有问题,观察该孔的上游裂孔是否有磁珠残留,用空白样品检查仪器在孔间的磁珠转移能力是否彻底。


3.磁棒核酸提取仪机器提取中加入的洗脱液体积与实际获得的核酸溶液体积不同。


目前市场上的磁棒核酸提取仪加热模块大多位于96孔深孔板的一、六、七、十二排。一排和七排大部分用作裂解和结合孔,而第六排和第十二排用作洗脱孔。因为大部分萃取实验在裂解结合步骤中需要加热,而第六排与第七排相邻,由于热传导效应的存在,使得热解加热时第六列洗脱液的温度也会升高,从而导致洗脱液的蒸发。因为洗脱液的体积很小(50μL-200μL),所以实际得到的核酸溶液的体积与加入的洗脱液系统的体积相差很大。


4.提取的核酸产量低。


A.样品体积与试剂的比例应控制在一定范围内,以免超过裂解能力。


B.粉碎和研磨的步骤。处理细节很重要。必须充分研磨,这是提取核酸的条件。


c、在洗脱步骤中,使用足够的洗脱剂进行洗脱并充分混合,以避免wjdtpod残留结块。


D.实验耗材要配套。比如不同的吸附柱或磁珠对核酸的吸附能力不同,也会影响核酸的产量。


5.提取的核酸被降解。


A.提取的样品量应符合试剂的比例,并尽量控制样品量达到适当的比例。


B.注意每一步都要充分均匀的混合,避免结块的残留影响实验结果。


C.在洗脱过程中,如果时间太长或温度太高,核酸可能会降解。


D.切记样品不要反复冻融,提取的样品要保存在适宜的温度下,长期保存尽量在-80℃。


6.提取的核酸纯度不够高。


A.样品量和试剂如裂解物的比例应尽可能控制在合适的范围内。


B.搅拌均匀,保证充分开裂,无块状残留物。


C.干燥的步骤要充分,否则可能会导致酒精等杂质的残留。


D.如果磁棒的振荡幅度过小或混合时间过短,磁珠上的杂质残留会影响磁珠吸附核酸的能力。

06

“磁珠核酸提取仪”的常见误区

误区一:磁珠用的越多,提取效果会越好。

很多老师喜欢在提取效果差的时候加大磁珠的量。他们认为更多的磁珠可以吸附更多的核酸。不得不说,这种想法是不可取的。


磁珠的主要特点是在外加磁场的作用下,能以固态分散在液体中或从液体中分离出来。任何试剂体系,磁珠与液体的比例都应该有一定的阈值。如果超过一定的比例,太多的磁珠会失去分散特性,因为它们不能均匀分散在液体中,在洗涤过程中核酸磁珠和液体之间的接触效率不能充分增加。过多的磁珠也会吸附更多的杂质,对除杂效果影响很大。有时,过多的磁珠会吸附液体体系中起主要作用的蛋白酶、溶菌酶等功能成分,导致整个试剂盒效率低下。在很多情况下,当提取效果不好时,减少磁珠的用量是提高提取效果方法。


通常磁珠法试剂盒给出的参比磁珠量略过量,需要增加磁珠量以提高吸附效率的情况并不多。但是,如果确定由于磁珠量不足导致提取效果不好,则可以通过在一定范围内增加磁珠量来提高提取效果。


以GNT-02系列磁珠为例,提取常量样品(植物组织、全血等)时。),通常用量为10ul/次;提取微量样本(如血清游离DNA、口腔拭子等)时。),磁珠量应在15~20ul/次。如果需要超过这个使用量,需要和技术工程师沟通。


误区二:使用的试剂越多,提取效果越好。


破解效果不好?添加更多的裂解溶液。洗涤效果不好?添加更多洗涤液。这是很多客户在使用套件时的习惯思维。


但是对于磁珠法来说,每增加一部分液体体积,磁珠的碰撞几率就会降低,降低磁珠的碰撞几率会导致吸附率的大幅下降。所以在很多情况下,虽然增加裂解液和洗涤液确实可以增强裂解和洗涤,但磁珠提取的核心是磁珠吸附核酸的效率,不保证磁珠的碰撞效率就无法保证核酸提取的效率。因此,简单地增加用于改善提取效果的试剂的量可能不是完全有效的。


对于GNT-B02全血基因组DNA试剂盒,裂解液和洗涤液的量分别不得超过400微升/次和500微升/次。如果真的需要对系统进行放大,那么磁珠和样品的量也要相应增加,而且这个放大不一定是成比例的。


误区三:洗涤次数越多,萃取效果越好。


当提取的核酸中杂质过多时,用户会考虑多洗几次,以获得更纯的核酸。增加洗涤次数确实有利于核酸的纯化,但考虑到每次洗涤都会损失一定量的核酸,增加核酸裂解和水解的可能性,一般将洗涤次数控制在2~4次为宜。


对于GN系列试剂盒,单个净化试剂盒洗涤次数为2次,植物和动物试剂盒洗涤次数为3次,血液试剂盒洗涤次数为3~4次。


误区四:取样越多,提取效果越好。


当样品不够新鲜或者核酸含量本身较少时,核酸提取效果往往较差,很多老师会通过多取样品来增加核酸提取量。


但单纯增加样品量有时会导致杂质过多,超过裂解液的裂解能力,降低提取效率。因此,不建议单纯增加样本量来达到增加提取量的目的。


如果由于样品量不足,提取量确实太低,建议在开始提取前进行富集或浓缩步骤。或者增加切割的完全性以暴露更多的核酸也是一种解决方案。


误区五:如果某一种磁珠是好的,那么它应该在所有实验中都很好用。


磁珠的种类很多,不同的粒径、不同的分散性、不同的磁响应时间、不同的包被基基质、不同的外部修饰官能团、不同的包被密度、不同的官能团臂长,都会导致磁珠的特性不同。


所以不同的磁珠所适应的实验和系统是不一样的。就像同样一种提取核酸的试剂,配方不完全一样,用于提取核酸的磁珠性质也不完全一样。


有些磁珠在提取大核酸时表现出更高的吸附效率,有些磁珠更适合提取微量核酸。有些磁珠适用于酸性试剂体系,有些磁珠适用于碱性试剂体系。有些磁珠磁响应好但沉降速度快,比较适合磁棒自动提取仪;有些磁珠沉降速度慢,但磁响应时间长,更适合移液自动提取仪。


少数几种磁珠可以用于所有实验。除了固定的试剂盒,在大多数情况下,磁珠和试剂系统必须调整一段时间。


误区六:与某个套件相比,效果不好,就是磁珠不好。


很多客户在筛选磁珠的过程中,只是在成熟的试剂体系下,简单的更换等量的磁珠,来比较磁珠的效果。


这样很容易得出某些磁珠效果不好的结论,但实际上由于不同的磁珠适用于不同的体系和剂量,往往需要调整才能得到更好的提取效果。

07

购买“核酸提取仪”

核酸提取仪常见的核心参数有:提取原理、机械原理、提取时间、样品通量、样品管容量、针尖头通量、针尖头数、接口、仪器重量、仪器尺寸等。同时,在购买核酸提取仪时,除了上述核心参数外,还需要考虑以下因素:

1.操作简单,使用方便。


每次提取时,操作人员只需做安装工作,布置孔板(提供提取所需的试剂)。整个提取过程不需要人工帮助,仪器自动完成,并尽可能配置中文界面,有利于学习仪器的使用和编辑程序,减少新操作人员的误操作,降低实验失败的风险。


2.高吞吐量、速度和便利性


根据不同的应用场景,可以实现一次快速处理尽可能多的样本,在短时间内完成提取,从而保证核酸提取的高效、快速和及时。


3.安全、环保、稳定、无污染。


操作中涉及的试剂盒和溶剂要尽量低,对人体无害。


4.低成本和开放平台


基于成本考虑,试剂耗材的消耗和供应周期在采购时也要考虑。尽可能选择适合不同厂家提取的不同规格耗材和试剂的兼容性高的仪器。


08

“核酸提取仪”的使用和注意事项

以某品牌核酸提取仪为例。


1.仪器的开箱和安装


1.打开仪器包装。

为了减少对仪器的人为损坏,请按如下方式打开包装。

剪断绑在仪器包装箱外的包装带,打开包装箱;

取下附件包装袋;

紧紧地抓住塑料泡沫,小心地将仪器连同塑料泡沫一起从包装箱中取出;

移除仪器外部的塑料泡沫和塑料袋;

抓住仪器的底部,将其可靠地放置在实验台上。

打开门,取下翼形螺钉和固定块,否则会损坏仪器。

注意:任何时候都不要用手柄移动仪器。

2.开箱检验

打开核酸提取仪包装后,用户需要检查收到的零件是否与装箱单相符。

3.仪器安装


3.1.仪器的放置


本仪器应放置在通风良好、无腐蚀性气体或强磁场干扰的室内。不要将仪器放在潮湿或多尘的地方。


仪器上的开口是为通风设计的。为避免过热,不得堵塞或覆盖这些通风口。温度过高会影响仪器的性能或导致故障。请勿在阳光直射下使用本仪器,并远离暖气、火炉和所有其他热源。


长时间不使用仪器时,拔掉电源插头,用软布或塑料盖住仪器,防止灰尘进入。


3.2.电源线的连接


a)注意电源的使用。


连接交流电源前,确保电源电压与仪器要求的电压一致(允许10%的偏差),并确保电源插座的额定负载小于仪器的要求。


b)注意电源线。


本仪器通常应使用随附的电源线。如果电源线损坏,必须更换而不是修理。必须用同型号同规格的电源线更换。使用本仪器时,不要按压电源线上的任何东西。不要把电源线放在有人行走的地方。


c)插入并拔出电源线。


插拔电源线时一定要握住插头。插入时确保插头完全插入插座,拔插头时不要拔电源线。


3.3.安装紫外线杀菌灯。


用户必须按照以下步骤自行安装紫外线杀菌灯(与荧光灯的安装方法一致):


a)将紫外灯管的插头从灯座的凹槽中推入灯座中;


b)旋转90度。


4.工作环境要求


考虑到仪器的安全性和性能,安装核酸提取仪的环境应满足以下条件:


非爆炸性环境;


正常大气压(海拔应低于3000米),环境温度为20-35℃,典型使用温度为25℃;;


相对湿度从10%到80%;


流动的空气应在35℃或以下;


避免过热和液体意外溅入仪器(不要将仪器放在热源附近,如电加热器。为防止电子元件短路,避免水或其他液体溅到仪器中)。


5.空气供应要求


核酸提取仪在35℃以下,需要足够的空气供应,以消散仪器内的热量。进气口和出气口位于仪器的背面。如果供气不足或空气温度过高,仪器会自动失灵甚至死机。


请确保充足的空气供应:


不要挡住进风口,核酸提取仪离其他垂直表面至少10cm,离其他热循环仪或加热仪器更远;


不要让灰尘或纤维聚集在进气口。


请确保空气足够凉爽。


不要在前面或后面放置两个或两个以上核酸提取仪(或其他仪器),以免排气口的热空气直接进入进气口。


测量仪器入口处的空气温度,确保进入仪器的空气温度为35°C或更低。


6.保护接地


a)仪器接地


为避免触电,仪器的输入电源线必须可靠接地。本仪器使用带第三(接地)针的三芯接地插座,只能与接地电源插座配合使用。这是一个安全装置。


如果插座无法插入插座,请请电工安装正确的插座,以免使接地插头失去安全功能。


b)远离带电电路。


操作人员不允许擅自打开仪器。零件的更换或机器的内部调整必须由经过认证的维护人员完成。请勿在连接电源的情况下更换组件。


注意:仪器三相电源输入端的接地端必须可靠接地。


二。操作保护和限制措施

1.操作前的保护


请完整阅读本手册,其中包含全面操作本仪器的必要信息。


安装:仪器应按照第1部分的要求打开包装并安装。核酸提取仪三相电源输入,接地


端子必须可靠接地。


2.运行中的保护


机器运行过程中禁止打开核酸提取仪的门,否则会对仪器造成损坏;


操作时,样品室加热器表面温度高,禁止触摸;


每次开柜都要切断电源。


3.确保风道畅通。


仪器用空气加热和冷却时,进气口和出气口必须畅通无阻。如果有灰尘,可以用软刷和湿布。


或者真空吸尘器。如果这些孔被灰尘或纤维堵塞,机器会有加热和排气障碍,导致


相关性能故障。


警告:为防止风道堵塞,请经常检查进风口和出风口的积尘情况。


4.危险因素


4.1样品污染


由于该仪器多用于检测污染样本,因此必须放置在PCR实验室内,操作人员必须遵守PCR实验室的相关规定,穿戴防护服、手套等相关防护措施。


4.2电源


确保使用核酸提取仪附带的电源线;只有主电源插头才能插入有接地保护的电源插座。没有保护地线就不能用延长线;


在切断主电源之前,请不要更换保险丝;


确保只使用实验所需的电流和特定型号的保险丝,禁止使用代用保险丝和短路保险丝盒;


仪器通电时,打开外壳或拆卸零件会造成人身伤害,因此在进行任何调整、更换、维护或修理前,请切断所有电源;


4.3缺陷和异常情况


当保护措施可能已经损坏时,停止使用仪器,并确保没有无意识的操作。如果仪器出现以下情况,保护设施可能已经损坏:


可见损坏;


无法开展预期工作;


运输压力太重,承载压力太重;


在不适当的条件下储存时间过长。