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技术支持

核酸提取方法、纯化及相关应用场景

更新时间  2022-08 阅读 255


1.1


摘要


核酸是由许多核酸聚合而成的生物大分子化合物,是生命最基本的物质之一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物和生物体中核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。核酸、化学的组成不同,核酸序列也不同。根据化学、核酸的组成可分为核糖核酸,简称RNA和脱氧核糖核酸,简称DNA。


DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础,RNA在蛋白质的合成中起着重要作用,其中转运核糖核酸,简称tRNA,起着携带和转运活性氨基酸的作用:mRNA是合成蛋白质的模板;核糖体核酸,简称rRNA,是细胞合成蛋白质的主要场所。



1.2


核酸提取样本


常见样本:血液、动植物组织、细菌、细胞、病毒、骨髓、体液等。


疑难样本:唾液、痰液、土壤、粪便、毛发、石蜡包埋组织、骨骼、牙齿、指甲、烟头等。

核酸提取仪.jpg


1.3


核酸提取方法


核酸两个分子,包括DNA和RNA,在细胞内与蛋白质结合。核酸提取的主要步骤是:裂解细胞去除与核酸结合的蛋白质和生物大分子如多糖和脂质,以及其他不需要的核酸分子,如提取。沉淀核酸纯化核酸去除盐和有机试剂等杂质。


1.3.1碱裂解法


碱裂解法是基于DNA变性和复性的差异来达到分离的目的。


1.3.2.煮沸法


煮沸时,样品中的DNA在核酸裂解物的作用下释放出来。离心沉淀后去除杂质,上清液可用于PCR扩增。


1.3.3浓盐法


RNA和DNA在电解质溶液中的溶解度不同而被分离。常用的方法是用1M氯化钠提取它们。用含有少量辛醇的氯仿摇动获得的DNP粘液,乳化,然后离心除去蛋白质。此时,蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相的中间,而DNA处于上层水相,用2倍体积的95%乙醇可提取/kloc。


1.3.4苯酚提取法


作为一种蛋白质变性剂,苯酚也抑制脱氧核糖核酸酶的降解。当匀浆用苯酚处理时,由于蛋白质与DNA之间的键已经断裂,蛋白质分子表面含有许多类似苯酚的极性基团。蛋白质分子溶于酚相,而DNA溶于水相。分离后,取出水层,重复操作多次,然后将含有DNA的水相合并,利用核酸不溶于乙醇的性质,将DNA用乙醇沉淀。此时DNA是一种非常粘稠的物质,可以用玻璃慢慢绕成一团取出。该方法的特点是将提取的DNA保持在自然状态。


1.3.5水浸提法


根据核酸的水溶性,组织细胞破碎后,用低盐溶液去除RNA,然后将沉淀物溶于水,使DNA完全溶于水。离心后,收集上清液,向上清液中加入固体氯化钠以调节至2。6M。加入两次95%的酒精,搅拌下立即搅拌出来,然后分别加入66%和80%的酒精。后风干得到DNA sample。这种方法提取的DNA蛋白质含量较高,一般不使用。为了去除蛋白质,可以对这种方法进行改进,在提取过程中加入SDS。


1.3.6阴离子洗涤剂法


蛋白质可用SDS或二甲苯钠等去污剂变性,DNA可直接从生物材料中提取。由于DNA与蛋白质在细胞内常以静电引力或配位键结合,又由于阴离子去污剂能破坏这种价键,DNA常被阴离子去污剂提取。


1.3.7硅胶薄膜法


可用于手动提取或自动提取。



硅胶法核酸萃取


1.3.8磁珠法


生物磁珠是一种新型的功能性固体载体,通常用于自动提取,其表面包覆有活性基团,可与多种生物活性物质偶联。它们还具有液体流动性和固体磁性材料的特性。它们可以在外部磁场的作用下定向移动和定居。去掉外磁场后,稍加振荡或抽吸,它们就能均匀地分散在液体中,从而使固液相的分离变得非常迅速和方便。通过简单的洗脱,可以获得高纯度的靶向。



1.5


提取核酸的目的


高完整性和高纯度的核酸分子的提取是下游分子生物学实验的基础。所以高质量的核酸提取是必不可少的,他可以做很多很多的分子生物学实验。这里简单介绍一下常见的分子生物学实验。


1.5.1个PCR


聚合酶链式反应(简称PCR)是一种分子生物学技术,通过扩增的方法扩增出特定的DNA片段。可以看作是一种特殊的DNA体外复制。PCR(聚合酶链式反应)的原理是DNA在体外95℃的高温下会变成单链,低温下(一般60℃左右)引物和单链会根据碱基的互补配对结合,然后将温度调整到DNA聚合酶的最适反应温度(72℃左右),DNA聚合。基于聚合酶的PCR仪其实就是一个温控装置,可以很好的控制变性温度、复性温度和延伸温度。


1.5.2转基因


转基因技术是指将基因片段转入特定生物体内,最终获得具有特定遗传性状的个体的技术。无论转移的基因来自进化树上更远的物种,接受者都可以读取它。这是因为DNA是一个通用代码,细胞知道如何读取它。即使是最密切相关的物种,如人类和细菌,也有许多相同的基因,这些基因在数十亿年中保持不变。基因从哪里来不是关键,发挥的功能就是它们的功能,所以转入动物基因的植物不会有动物的味道。


转基因技术的理论基础来自于进化衍生的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物基因组所需的目的基因,也可以是人工合成的具有特定序列的基因片段。将基因片段转入特定生物体内,与其自身基因组重组,然后从重组体中人工繁殖世代,从而获得具有特定遗传性状的个体。这项技术可以增加重组生物的预期新性状,培育新品种。


1.5 .3基因文库的构建


用限制性酶部分消化生物体的基因组DNA并将限制性片段插入载体DNA分子中。插入了基因组DNA片段的所有这些载体分子的集合将包含该生物体的整个基因组,即构成该生物体的基因文库。将这些载体引入受体细菌或细胞,使得每个细胞包含基因组DNA片段和载体重组DNA分子。经过繁殖和扩增后,许多细胞一起包含了生物体的全部基因组序列。我们称这种集合体为基因库。


将某一生物细胞的total DNA或染色体DNA的所有片段通过重组DNA技术随机连接到基因载体上,然后转入合适的宿主细胞,通过细胞增殖形成每个片段的克隆系统(克隆)。当制备的克隆的数量足够大以包括某一生物体的所有基因时,整组克隆将是相同的定义也适用于线粒体DNA或叶绿体DNA生物体的基因文库。因为DNA片段的截断点是随机的,所以每个克隆中包含的DNA片段可能是一个或几个基因,也可能是一个基因的一部分,或者除了完整基因之外还包含两侧相邻的DNA序列。


1.5.4分子测序


用DNA聚合酶合成与模板互补的DNA链,在三维空间记录模板位置和核苷酸序列信息,然后反向构建模板的序列。除了DNA合成反应的三要素(模板、酶、核苷酸)外,模板的位置和单色荧光标记的核苷酸序列在反应循环中的位置(如何A、C、G、T)也是最终DNA序列要完成的关键要素。如果用四种不同的荧光标记反应中使用的核苷酸,那么在每个反应循环中就需要切换不同波长的光来记录不同的碱基。


1.5.5分子诊断


分子诊断:利用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化来做出诊断的技术,称为分子诊断。分子诊断是预测性诊断的主要方法,既可用于个体遗传病,也可用于产前诊断。分子诊断材料包括DNA、RNA和蛋白质。


分子诊断主要是指检测编码与疾病相关的各种结构蛋白、酶、抗原、抗体和免疫活性分子的基因。


1.5.6亲子鉴定


亲子鉴定是运用法医学、生物学、遗传学的理论和技术,从子代和父母的形态结构或生理功能上分析遗传特征,判断父母和子女是否亲生。亲子鉴定是司法物证鉴定的主要组成部分。亲子鉴定在中国古代就有了,比如骨滴、血滴。


DNA亲子鉴定的操作步骤如下:


步骤1: DNA提取


将样品细胞核中含有的DNA提取出来,然后纯化除去样品中的杂质。


二步:PCR扩增


PCR的中文名字叫聚合酶链式反应。简单来说,华科基因PCR扩增的步骤就是通过酶促反应,在PCR仪上大量复制出我们需要的片段,扩增到可以通过一些特殊的仪器看到的程度。


步骤3:后PCR反应


这一步主要是在ABI测序仪检测的准备阶段。双链DNA是开放的,增加了一些检测的内标,主要是标记检测到的片段长度。


步骤4:用毛细管测序仪检测。


因为DNA是带电荷的,毛细管电泳不同片段DNA长度的电泳速度不同。在同样的电压下,同样的电泳时间,游泳距离是不一样的。这些不同的距离可以通过前期加入的内标测量来区分,并通过一定的软件显示在电脑上,方便检测人员对数据进行处理和分析。


第五步:分析数据,出具报告。


主要检测人员会对得到的结果进行分析、汇总、计算,然后拿出鉴定结论和报告。


1.5.7法医鉴定


司法鉴定是司法程序中技术工作的重要组成部分。是运用医学、生物学、人类学、物理学、化学等知识对活体、尸体以及与人有关的生物证据的检验和鉴定。,从而获得死因、损伤程度、凶器类型、血型分析、事实确认等结论性意见。司法鉴定结论是三大诉讼法中的重要证据类型。由于与人身关系密切,司法鉴定结论在诉讼和非诉讼活动中具有重要意义。它是查明案件事实、区分案件性质的重要依据。同时也是鉴定案件其他证据是否真实的重要手段。可以说,司法鉴定的质量在一定程度上影响着司法公正。


1.5.8基因敲除


敲除(Knockout)是指一种基因工程技术,针对功能已知但未知的序列,改变生物体的遗传基因,使特定基因的功能失去作用,从而使部分功能被阻断,可以进一步影响生物体,进而推断该基因的生物学功能。


基因敲除和基因嵌入是上世纪90年代出现的新外源DNA导入技术。基因敲除是一种基因打靶技术,类似于基因的同源重组。是指外源DNA基因与受体细胞基因组中相同或相似序列的同源重组,从而替换受体细胞基因组中相同/相似的基因序列,并整合到受体细胞基因组中。这种方法可以产生准确的基因突变,纠正生物体的基因突变。基因嵌入又称基因置换,是利用内源基因序列两侧或外侧的断点,将内源基因完全替换为同源序列的目的基因。目前用于基因敲除和基因嵌入的有Cre/Lox P系统、FLPI系统等。


1.5.9基因芯片


基因芯片(genechip,又称DNA chip,生物芯片)的雏形于20世纪80年代中期提出。基因芯片的测序原理是杂交测序法,即与一组已知序列的核酸探针杂交确定核酸序列,将8个已知序列的核苷酸探针固定在一个基片表面。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG与基因芯片上相应位置的核酸探针互补匹配时,通过确定荧光强度强的探针的位置,可以得到一组序列完全互补的探针序列。所以target 核酸的序列可以重组。


1.5.10 .动植物资源的保存和鉴定


建立濒危野生动植物遗传资源库,实施濒危野生动植物遗传保护工程,对于我国濒危野生动植物的保护和繁衍,对于维护我们赖以生存的环境生物多样性和生态链平衡,无疑具有重要意义。然而,对于已经进入生物经济时代的人类来说,其意义远不止于此。


提取高质量的核酸在其他领域和方向有重要作用。但是仅仅依靠传统的核酸萃取方式,很难满足日益增长的中文核酸萃取市场,所以全自动核酸自动萃取器的出现将为中文核酸萃取市场带来一抹亮色。