分子诊断基于核酸，主要用于临床实验室各种疾病的诊断，如肿瘤、感染、遗传等。，而核酸提取是分子诊断实验的“一步”。几乎所有的实验都是基于核酸提取，以及后续的克隆，PCR，q PCR，建库，测序等。都需要核酸提取才能顺利进行。核酸的提取纯化质量是保证核酸检测数据准确性的前提，也是分子诊断产业发展的前提。今天，边肖将为您学习核酸在各种平台中的应用以及相应的技术原理。

在PCR技术中的应用

根据核酸的提取方法不同，可分为磁珠纯化法、硅胶膜离心柱法、溶液提取法三大类。随着2020年新冠肺炎疫情的爆发，分子检测从曾经的王协颜飞入寻常百姓家，让越来越多的人知道了核酸 detection。Q PCR因其特异性强、灵敏度高而成为新冠肺炎核酸检测中应用最广泛的技术。q PCR实验操作中必不可少的步骤是核酸提取。为防控新冠肺炎疫情，各地开展了大规模的核酸检测，其中磁珠法 核酸提取因其速度快、提取浓度高而被广泛使用。

磁珠法原理:通过纳米技术对超顺磁性纳米粒子进行表面改进和表面修饰(如硅基、氨基、羧基等)后，制备出超顺磁性二氧化硅纳米粒子。核酸主要通过静电、疏水、氢键等方式与磁珠结合。在裂解物的作用下，RNA被释放出来。此时，磁珠与核酸分子“特异性结合”，形成“核酸—磁珠复合物”。在离液盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)的作用下。)和外磁场，复合物被分离。用洗脱液洗涤非特异性吸附的杂质，脱盐纯化，得到提取纯化的核酸近年来，随着自动化仪器的快速发展，基于磁珠法原理的全自动 核酸提取仪由于能满足实验室大批量样品的需求，越来越多地应用于核酸检测。国产核酸提取仪品牌很多，比如Xi安天龙，乐普医疗。

磁珠法提取原理

核酸提取除磁珠纯化外，还可采用硅胶膜离心柱法和溶液提取法。边肖将帮助你了解这两种方法的提取原理。

硅胶离心柱法:主要用于微量核酸的分离纯化，利用裂解液促进细胞破碎释放核酸于细胞内。由于硅胶模只对核酸有很强的亲和力和吸附作用，而不吸附蛋白质、多糖、脂类等其他生化成分，因此释放的核酸被特异性吸附在硅胶膜上，而其他成分在离心过程中被甩出柱外。用洗脱液洗脱硅胶膜吸附的核酸，得到纯化的核酸。该方法不仅成本低，而且提取质量好。

溶液萃取:是最经典的萃取方法，几乎都使用有机溶剂如(SDS、CTAB、苯酚/氯仿)和盐类如Tris、EDTA、NaCl等。除了提供合适的裂解环境，还包括抑制核酸 by 核酸酶(如EDTA)的破坏，维持核酸(如NaCl)的结构稳定性等。有机溶剂使蛋白质变性，破坏膜结构，去除与核酸相连的蛋白质，使核酸在裂解体系中解离。由于苯酚和氯仿有毒易挥发试剂、核酸、回收率低、损耗大、工艺复杂，已逐渐被吸附柱法和磁珠法取代。

PCR的大部分下游应用对核酸的质量要求不高，但需要一个快速的提取过程来缩短实验时间，提高实验效率。市面上逐渐出现了各种核酸 fast 提取仪比如:全自动 核酸萃取净化器MolecisionMP-32可以在7分钟内快速萃取16-32个样品。

二代测序中的应用

在二代测序技术平台的肿瘤基因检测项目中，不同的采样方式会产生不同的样本类型，通常是血液样本和组织样本(包括新鲜组织、福尔马林浸泡组织、石蜡包埋组织、石蜡线圈、石蜡切片等。).血液样品需要经过血浆分离步骤，并且可以在核酸提取之前分离白细胞和血浆样品。白细胞提取方法和血浆提取方法完全不同，所以需要不同的提取试剂盒。根据保存方法的不同，标本可分为福尔马林浸泡组织和石蜡包埋组织。

白细胞提取原理:先破坏红细胞，利用红细胞和白细胞的膜结构差异，先裂解红细胞，离心后收集白细胞。之后，膜蛋白和核蛋白变性，白细胞溶解并释放出游离DNA。通常，离子表面活性剂用于使蛋白质变性。然后，去除变性的蛋白质，将DNA留在上清液中。DNA在高盐环境中从有机溶剂如无水乙醇中沉淀出来。

血浆提取原理:血浆DNA又称循环DNA和游离DNA，是指血液中游离于细胞之外的DNA。主要来源是白细胞解体释放的DNA，坏死组织特别是肿瘤组织释放到血液中的DNA，以及感染的病毒。对于样品少的实验室，优选的核酸提取方法是离心柱法。原理是样品裂解后，游离的DNA在高盐下与硅胶膜结合，然后在低盐高PH值下洗脱硅胶膜上的DNA。

新鲜组织提取的原理类似于白细胞提取的原理。只是预处理方法不同，组织提取需要消化。使用蛋白酶K和裂解物来消化组织并从组织细胞中释放DNA。实验室为了达到较好的消化效果，通常会隔夜消化，以获得高浓度的DNA。石蜡包埋组织的消化需要加入脱蜡剂脱蜡，然后进行组织消化，提取DNA。

第三代测序中的应用

SMRT测序是一个广泛应用的第三代测序技术，具有长阅读长度的特点。为了满足长阅读的要求，提取高分子量的DNA是非常重要的。按照层析柱法和磁珠法，不容易获得高分子量DNA。电泳技术可用于从微生物中提取高分子量DNA。

微生物超高分子量DNA提取原理:采用琼脂糖包埋法，在微生物细胞悬液中加入琼脂糖，裂解细胞，促进DNA释放。该方法提取的DNA经电泳洗脱、凝胶切割和回收后，分子量可达300kb以上，将为第三代测序提供重要支持。

在核酸检测中，提取和纯化是影响检测结果的重要因素，也是分子检测的重要组成部分。受新冠肺炎疫情影响，全球及国内市场对核酸提取纯化试剂 box的需求持续上升，行业未来仍有较大发展潜力。在核酸萃取提纯试剂 box生产方面，国外公司前期占领了国内市场。在新冠肺炎核酸检测市场需求的推动下,核酸提取纯化试剂行业加速国产化进程，国产品牌市场占比持续提升。目前，分子诊断中的核酸检测占据主要市场，而生物芯片是未来的重要趋势。